RNA免疫共沉淀测序
发布时间 2017-09-14
RNA Immunoprecipitation (RIP) 是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行测序分析。将RIP技术结合新一代测序技术，应用于癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化检测。
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样本要求
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测序策略
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交付周期
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样品类型: RNA样品
样品浓度: ≥2ng/μl
样品总量: ≥50ng
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测序模式：Hiseq3000/4000 (PE150/SE50)
测序深度：10/20M clean reads
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60天
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与RIP芯片相比，可在全转录组范围对蛋白结合位点进行筛选与鉴定，且敏感度高;
可获得高水平的信噪比数据，准确区分真实事件与噪音，精确定位蛋白结合位点;
深度测序保证了检测随机性，可不需技术重复。
RIP-seq研究RNA甲基化调控RNA二级结构影响RNA与蛋白质相互作用
研究背景:
RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰（N6-methyladenosine，m6A）是高等生物RNA上含量最为丰富的一种RNA表观修饰形式，这种表观修饰会参与到很多转录后调控过程中，与多种生理功能有关，是一类极为重要的表观修饰。一个与肺癌转移相关的lncRNA（MALAT1）的茎环结构上具有一个m6A修饰位点2577-A/m6A，该位点修饰状态会改变数种核酸酶对MALAT1的消化能力，从而影响RNA的稳定性。HNRNPC蛋白能特异结合新生mRNA多聚尿嘧啶区域影响其靶点的稳定性、剪切、运输及翻译过程。
研究内容：
1. CLIP-MeRIP分析
针对HEK293T，METTL3KD两个细胞系进行HNRNPC特异抗体CLIP，分离RNA进行MeRIP，构建small RNA文库，SE50测序。分析甲基化转移酶（METTL3）缺失抑制RNA发生m6A甲基化对蛋白质HNRNPC结合RNA能力的影响以及结合位点的序列偏好性，研究结果证实，RNA甲基化能够增强HNRNPC结合RNA的能力（图1）。
2. RNA甲基化调控基因分析
针对HEK293T，HNRNPC KD , METTL3 KD, METTL14 KD四个细胞系进行RNA-seq，筛选RNA甲基化调控基因。有接近1000个包含m6A开关的转录本出现变化，对这些基因进行功能富集分析，GO分析表明这些转录本所对应的基因与细胞增殖等生物过程有关，说明RNA甲基化能够影响肿瘤的增殖，并通过体外试验验证该结论。
研究结论：
转录后的m6A修饰可以通过调控RNA-HNRNPC互作来影响编码以及非编码RNA的结构，从而进一步影响核内基因转录及成熟过程，从而影响细胞的增殖，在肿瘤的发生发展中起重要的调控作用。
1. Liu N, Dai Q, Zheng G, et al. N6-methyladenosine-dependent RNA structural switches regulate RNA-protein interactions [J]. Nature, 2015, 518(7540):560.
