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三代测序之微生物基因组

发布时间:2018-06-01 17:00:00      点击数:

三代基因组测序:Pacbio SMRT(单分子实时测序)平台,基于纳米孔的单分子读取技术,通过 DNA 聚合酶与单个 DNA 模板分子结合释放的荧光信号判断配对碱基的类型,由此测定 DNA 模板序列。

三代基因组优势:超长读长、无GC偏好性、高灵敏性、测序时间短和无需扩增等。

 PacBio 平台为基础的单分子实时测序技术。通过 DNA 聚合酶与单个 DNA 模板分子结合释放的荧光信号判断配对碱基的类型,由此测定 DNA 模板序列。具有超长读长,无需扩增,无 GC 偏好性,准确率高,同步识别等优势,使基因组组装水平提升到一个新的高度。

今天就来给大家介绍一下三代测序技术在微生物基因组研究上的应用。

信息分析流程:

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分析内容:

一、组装后质控

基因组覆盖的均匀性,也是组装质量的重要指标,测序覆盖越均匀,每个单碱基的重复次数越好,最终结果的准确性也就越高。以三代测序为例,全基因组范围测序数据覆盖是较为均匀的。

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组装结果覆盖深度统计

二、基因组结构注释及结构展示

1、编码基因

2、重复序列:重复序列主要分为散在重复序列和串联重复序列

3、非编码基因:包括tRNA,rRNA及sRNA。

4、基因岛(Genomics Islands,GIs):是一些细菌、噬菌体或质粒中通过基因水平转移整合到微生物基因组中的一个区段。基因岛与病原机理、生物体的适应性等多种生物功能相关。

5、转座子(transposon,Tn):存在于染色体DNA上可以自主复制和移位的基本单位。转座子可以在不同复制子之间转移,以非正常重组方式从一个位点插入到另外一个位点,对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效应。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列(IS),它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。

6、前噬菌体:整合在宿主基因组上的温和噬菌体的核酸称之为前噬菌体,能随宿主细菌DNA进行同步复制或分裂传代。前噬菌体序列的存在可能会使一些细菌获取抗生素抗性,增强对环境的适应性,提高粘附力或使细菌成为致病菌。

7、CRISPR:CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat Sequences)是与噬菌体或质粒同源的短重复序列,通过对外来同源的DNA作用对噬菌体有抗性,是原核生物免疫系统的一部分。

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完成图圈图展示

由外到内各圈依次为:编码基因、ncRNA、基因组GC含量,基因组GC skew值分布。

三、基因组功能注释

基因功能注释主要是基于氨基酸序列比对。将蛋白序列基于BLAST与一系列基本功能数据库进行比对(blastp, evalue ≤ 1e-5)得到对应的功能注释信息,以解释编码基因在细菌生理中的功能。

基本功能数据库包括:NRSwissProtTrEMBLPfamGOKEGG

GOCOG为例,可以在将基因的功能归属到丰富的功能分类中去。

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GO功能注释图

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COG功能注释图

四、比较基因组研究

通过软件比对分析,可以解析目标基因组和参考基因组之间的共线性关系,并进而检测基因组间的变异。

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多个物种的同源基因家族Venn

五、基因组进化分析

基于多个基因组间的单拷贝基因信息,可以构建菌株间的系统进化树,用于解析菌株之间的进化关系。

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多个物种的进化树图

六、基因组表观修饰分析

由于原始数据(bax.h5)含有碱基测序的动力学特征数据。通过挖掘原始数据,可以准确的知道在全基因组哪些位点发生了碱基甲基化修饰,目前可以检测的类型包括 m4Cm6A

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甲基化分析动力学检测结果

目前PacBio三代测序技术除了应用在微生物基因组,还应用在动植物基因组denovo组装、微生物基因组、以及全长转录组方面。未来的潜在应用还有碱基修饰检测、16S全长检测、目标基因检测等方面。

 

参考文献

1Single-molecule,full-length transcript sequencing provides insight into the extreme metabolismof the ruby-throated hummingbird Archilochus colubris.

2Comparativegenomic and functional analyses: unearthing the diversity and specificity ofnematicidal factors in Pseudomonas putida strain 1A00316.

3Draft Sequences of the Radish (Raphanussativus L.) Genome.