iTRAQ (isobarictags for relative and absolute quantitation，同位素标记相对和绝对定量)是由AB SCIEX公司研发的一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术使用8种（或4种）不同的同位素试剂来同时标记和比较8种（或4种）不同的蛋白质样品。这些试剂由3个不同的化学标签组成：报告部分，肽反应部分和平衡部分。报告部分为客户可按需选择标记个数，肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连，可标记所有酶解肽段，平衡部位可保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比，因此改变任一iTRAQ试剂，不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量都完全相同。而在串联质谱中，同重元素标记肽段平衡基团在二级质谱发生中性丢失。信号离子表现为不同质荷比的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息。

（1）一次实验可进行2-8个样品相对定量，适合如大量临床样本，多对照组实验等规模样本研究；

（2）可检测出较低丰度的蛋白；

（3）技术路线简单，不需要额外繁琐的操作；

（4）对于发现生物标记物，是一种高通量的研究方法；

研究背景

  DAI（弥漫性轴索损伤）是一种严重且复杂的脑损伤，目前临床上没有相关可靠的生物标志物帮助其进行早期DAI诊断。因此，作者建立了DAI大鼠模型，并利用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选与DAI相关的血浆生物标志物，该研究既有助于DAI临床诊断的发展，也对DAI潜在分子机制有了进一步了解。

研究内容

   在本研究中，作者构建了DAI大鼠模型，并应用iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选与DAI相关的差异表达的血浆蛋白。基于蛋白质组学结果和蛋白的生物学功能，作者筛选得到了两个蛋白（Hpx和GAPDH）作为潜在的诊断生物标志物，它们可能在DAI的轴突损伤的生物过程中发挥重要作用。作者的研究结果不仅为DAI的分子机制提供了新的见解，而且还促进了DAI临床诊断生物标志物组的开发。

研究结果

   在对血浆样品进行iTRAQ蛋白质组学分析中，共鉴定到374个蛋白质，其中共有58个显著差异蛋白（FC > 1.5，p-values < 0.05），和对照组相比，不同时期的模型组中差异蛋白数目如图1。针对这些差异蛋白，作者进行了GO功能分析和KEGG Pathway分析（图2）。根据58个差异蛋白的层次聚类分析结果，在3 d和7 d中的蛋白质丰度发生显著改变（图3A）。这可能是因为DAI的发病机制复杂，涉及多阶段的生物学过程，轴突损伤1 d后可能与不同的分子机制有关。为了研究不同差异蛋白的相互作用，作者又进行了蛋白互作网络分析，结果显示GAPDH和Hpx等几种蛋白质位于蛋白质功能相互作用网络的中心位置（图3B）。

图1 不同DAI时期蛋白表达火山图

图2 差异蛋白GO功能分析和KEGG Pathway 分析

图3 差异蛋白层次聚类分析和蛋白互作网络分析

   Peng Zhanga, Shisheng Zhu, et al. Identification of plasma biomarkers for diffuse axonal injury in rats by iTRAQ-coupled LC–MS/MS and bioinformatics analysis. Brain Research Bulletin, 2018 , 140.