第三代单分子测序技术经过近些年的不断开发与技术革新逐步迈向成熟。以微生物为代表的小型基因组领域为例，依靠其超长的数据长度和精准的一致性序列信息，三代测序技术已经取代二代测序技术成为基因组de novo 领域的金标准。未来，科研人员将告别微生物基因草图或精细图时代，基因组完成图将是科研工作者分析菌株的起点。

  *标准微生物：A.基因组大小＜7M  B.样品不含有其他物种DNA污染  C.染色体基因组个数+质粒个数≤5  D.转座子或其他重复序列小于30kb，或者转座子或其他重复序列在基因组中的比例无异常（＞25%）

超长读长，平均读长可达20kb,最长读长可达70kb，Subread Length N50可达20kb;

无GC偏好，全程无需PCR扩增；

可实时检测基因组上的碱基修饰情况，如6-mA,4-mC等；

比较基因组学和功能分析:发现恶臭假单胞菌中杀线虫因子的多样性和特异性

研究背景:

   恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）1A00316是唯一一株被报道能够抗线虫的恶臭假单胞菌。该菌株是从特殊环境南极土壤中分离得到的，通过对1432株极地来源的细菌进行抗南方根结线虫的离体筛选，发现其中南极土壤来源的菌株恶臭假单胞菌1A00316在离体和活体中均表现出比较好的抗性，其生防效果达到71.67%。该项目实施前期，研究人员尝试利用Illumina测序平台进行基因组测序组装，进过反复优化最终获得43个Contigs,无法进行后续分析。后改用PacBio测序平台，仅用一周时间就完成该基因组的测序组装，获得基因组完成图，为后期更完善的研究杀线虫因子及抗性机制提供了良好的研究基础。

实验设计：

   对恶臭假单胞菌1A00316的高质量基因组DNA，构建20kb标准文库，使用P6+C4试剂测序获得了100x覆盖度的三代数据，并使用纯三代数据组装策略获得基因组完成图。在得到完整的基因组序列后，通过比较基因组学方法对16株已完整测序的假单胞菌从基因组特征、系统发育树、蛋白家族、抗线虫因子等进行了全面分析。最后基于比较基因组学结果并结合一系列生化及生理实验验证了恶臭假单胞菌1A00316中杀线虫因子的结构及功能。

实验结果：

  （1）通过PacBio测序最终获得恶臭假单胞菌1A00316的基因组——由长度为5,715,815bp的一条完整的环状染色体组成，含有5,039个蛋白编码基因，22个rRNA基因及76个tRNA基因，GC含量为64.4%（图1）。该结果显示三代PacBio用于微生物基因组组装非常方便高效。

  （2）通过比较基因组学分析发现恶臭假单胞菌1A00316在进化关系上与其他恶臭假单胞菌有比较远的距离，但毒力因子及蛋白家族上和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）更加相似（图2）

图1.恶臭假单胞菌1A00316的基因组完成图 

图2 .16株假单胞菌比较基因组学分析结果 （左：系统发育树；右：蛋白家族）

图3.不同物种中抗线虫因子合成基因簇的比较 （左：AprA合成基因簇的比较 右：HCN合成基因组的比较）

       Jing G, Jing X, Peng W L, et al. Comparative genomic and functional analyses: unearthing the diversity and specificity of nematicidal factors in Pseudomonas putida strain 1A00316[J]. Scientific Reports, 2016, 6:29211.