基本信息

期刊：Aging

影响因子：5.515

发表时间：2020.3.28

背景信息

结直肠癌是一种严重危害人类生命的恶性肿瘤。美国癌症统计数据显示，结肠癌发病率居全球恶性肿瘤的第三位，死亡率居所有肿瘤第二位。据报道，饮食、息肉和慢性炎症等都与结直肠癌发病机理有关，但是结直肠癌在基因组和表观遗传学的作用仍然鲜为人知。而且，尽管接受了标准疗法如外科手术结合化学疗法和放射疗法，许多结直肠癌患者最终仍会复发或转移。因此，迫切需要进一步研究结直肠癌致癌的分子机制，寻找和开发结直肠癌有效的治疗靶点。

1、结直肠癌中9个潜在的circRNAs

图1

使用GEO数据库选择进行分析的GSE126095数据集（含有三个子数据集GSE126092，GSE126093和GSE126094）；利用GEO数据库提供的GEO2R工具对GSE126094进行差异表达分析，共筛选出1850个差异的circRNAs（图1A）；以|log2FC|>4的筛选标准最终鉴定出6个上调的circRNAs和4个下调的circRNAs（图1B和表1），这10个circRNAs的来源基因如表2。使用CSCD数据库鉴定了9个circRNAs的结构，这9个circRNAs都具有MRE（图2）。

表1

表2

图2

2、结直肠癌中潜在circRNAs的结合miRNAs的预测和分析

通过starBase数据库预测9个circRNAs结合的miRNAs，为了更好的可视化，使用Cytoscape软件建立了circRNA-miRNA网络图如图3。

图3

根据ceRNA的假设，理论上circRNA的表达应与miRNA的表达负相关。作者使用GEO2R工具对GSE126093数据集进行差异表达分析，并鉴定出178个重要的DEmiRNAs（图4A）。通过circRNAs靶向miRNAs和重要DEmiRNAs取交集，发现miR-145-5p出现在上调的DECs靶miRNAs和下调的DEmiRNAs中（图4B），7个miRNAs（miR-3127-5p、miR-761、miR-4766-3p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-374a-3p和miR-330-3p）在下调的DECs靶miRNAs和上调DEmiRNAs中（图4C）。使用TCGA数据库验证了这8个miRNAs的表达水平如图4D–4K所示，结果表明只有miR-145-5p、miR-4766-3p、miR-135b-5p和miR-374a-3p的表达与先前的分析结果一致。因此，这4个miRNAs可能是结直肠癌中关键circRNAs最有潜力的下游miRNAs。

图4

通过预测的circRNA-miRNA结合对发现miR-145-5p与上调的hsa_circ_0001955结合，而miR-4766-3p、miR-135b-5p和miR-374a-3p这三个与下调的hsa_circ_0000977结合（图5A）。使用来自GSE126094和GSE126093的数据确定了四个circRNA-miRNA结合对的表达相关性（图5B-5E），这4个miRNAs与其对应的配对circRNA均呈负相关，这符合ceRNA假设；但是只有hsa_circ_0001955/miR-145-5p和hsa_circ_0000977/miR-135b-5p具有统计学意义，说明hsa_circ_0001955/miR-145-5p和hsa_circ_0000977/miR-135b-5p可能是致癌的两个重要轴。

图5

3、结直肠癌中miRNAs下游靶基因的鉴定

通过miRNet数据库预测miR-145-5p和miR-135b-5p的靶基因，分别有238个和83个靶基因。使用GEO2R工具对GSE126092数据集进行差异表达分析，共筛选出2787个DEGs（图6A）。根据miRNA的作用机理，miRNA的表达应与靶基因的表达负相关。对靶基因和DEGs进行了交叉分析，miR-145-5p的靶基因和上调的DEGs共有基因有19个（CBFB、CD44、CDK4、CDK6、CFTR、MMP1、MMP12、MYC、PIGF、POU5F1、ROBO2、SNTB1、TGFBI、VEGFA、PSAT1、LMNB2、RAB3IP、C11orf65和CRNDE）（图6B），miR-135b-5p的靶基因和下调的DEGs共有的基因有10个（APC、FOXO1、MBNL1、MEF2C、RECK、KLF4、PPM1E、ARC、TTLL7和PCP4L1）（图6C）。通过starBase数据库和TCGA数据库进一步验证了19个上调基因和10个下调基因的表达水平。结果表明，17个上调的基因（除CFTR和POU5F1外）和10个下调的基因分别符合先前的分析结果（图6D和6E）。

图6

4、结直肠癌中建立潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络

作者构建了miR-145-5p靶基因网络图（图7A）和miR-135b-5p靶基因网络图（图8A）。miR-145-5p的表达与17个靶基因表达反向关联，而只有miR-145-5p/CBFB、miR-145-5p/CDK4、miR-145-5p/MMP1、miR-145-5p/MMP12、miR-145-5p/ROBO2、miR-145-5p/SNTB1、miR-145-5p/TGFBI、miR-145-5p/LMNB2、miR-145-5p/RAB3IP和miR-145-5p/CRNDE对具有统计学意义（图7B-7R）；miR-135b-5p与10个靶基因的表达相关性分析结果表明miR-135b-5p/FOXO1、miR-135b-5p/MBNL1、miR-135b-5p/MEF2C、miR-135b-5p/RECK、miR-135b-5p/PPM1E、miR-135b-5p/TTLL7和miR-135b-5p/PCP4L1具有统计学意义（图8B-8K）。

图7

图8

作者使用TCGA数据进一步确定miR-145-5p或miR-135b-5p与它们的靶基因之间的表达关系，通过对GEO和TCGA数据库的分析结果，发现CDK6、MMP12和RAB3IP是miR-145-5p潜在的下游靶基因，FOXO1、MBNL1、MEF2C、RECK、PPM1E、TTLL7和PCP4L1是miR-135b-5p潜在的下游靶基因。根据ceRNA机制，circRNA表达应与靶基因表达呈正相关，研究发现这10个基因均与其相应的circRNA显著正相关（图9A–9J）。随后在结直肠癌中建立了潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络（图10），通过qRT-PCR确定构建的网络中所有RNA的表达水平，并评估它们之间的表达关系，证实这与GEO和TCGA数据库中分析结果一致（图11A-11E和图12A-12I），此外部分分析也支持了计算机分析的准确性（图11F-11L和图12J-12X）。

图9

图10

图11

图12

总之，这项研究通过全转录组分析、交叉分析和相关分析等揭示了在结直肠癌中hsa_circ_0001955/hsa_circ_0000977介导的潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络。虽然还需要更多的实验和临床验证，但是此网络中的靶向治疗仍可能是结直肠癌患者有效的治疗方法。

参考文献

Ding Bisha,Yao Minya,Fan Weimin et al. Whole-transcriptome analysis reveals a potential hsa_circ_0001955/hsa_circ_0000977-mediated miRNA-mRNA regulatory sub-network in colorectal cancer.[J] .Aging (Albany NY), 2020, 12: 5259-5279.