研究结果  

1. 沉积物和海水样品中DAA利用菌的多样性

首先，作者利用2种不同培养基（A和B）来研究表层海水样本和沉积物样本中DAA利用菌的多样性，结果表明，表层海水和沉积物中的DAA利用菌多样性丰富。相同样品不同培养基（A和B），DAA利用菌的多样性存在差异，说明不同DAA能够被不同的细菌利用；而相同培养基不同样品，DAA利用菌多样性也存在差异，说明不同海洋环境的占主导地位DAA利用菌可能也会存在差异（图1）。

图1  DAA利用菌的相对丰度

2. 7种细菌利用DAA的能力

表1  DAA利用菌株及培养基信息

图3  单一DAA作为唯一氮源培养的7株菌生长情况

利用A或B培养基的单一DAA作为唯一氮源，比如D -Asp, D -Ser, D -Leu，D -Met、D -Tyr、D -Thr或D -Phe（表1），最终分离出7株DAA利用菌，隶属于3个门12个科。

为了进一步研究分离细菌利用不同DAA的能力，作者将7株菌在含有单一DAA作为唯一氮源的培养基中进行培养，发现其中3株菌可以同时利用多种DAAs,例如 Halomonas

titanicae SM1922，Pseudoalteromonas neustonica SM1927，和Paenarthrobacter nitroguajacolicus SM1928（图3A-C）。而另外4株菌只能利用1种DAA（图3D-G）。

3. 与细菌DAA代谢相关的关键基因预测

除了菌株SM1926 没有找到与DAA代谢相关的关键基因，其他6株菌都有DAAs氧化还原酶、脱氢酶的编码基因，一些菌株还包含 D-丝氨酸的脱氨酶编码基因以及DSD1编码基因（表2）。

通过RT-qPCR验证，发现SM1922主要是利用FAD-binding氧化还原酶的编码基因 FQP89_11185，来代谢不同的DAAs,例如D -Asp, D -Leu, and D -Thr。DAA转氨酶的编码基因 FQP89_01185也与D-Asp的代谢有关（图4A-C，表2）。另外，SM1927的FAD-binding氧化还原酶的编码基因FQP85_04150明显上调，说明它是SM1927菌株DAAs代谢的关键基因（表2，图4D）。菌株SM1928通过依赖FAD氧化还原酶，来代谢D -Tyr（表2，图4E）。菌株SM1928中，D -ser  ammonia-lyase DSD1 编码基因 FQP90_13285和FAD-dependent oxidoreductase的编码基因FQP90_21520与 D-Ser代谢有关，并且D -serine ammonia-lyase DSD1 更加重要（表2，图4F）。因此，海洋细菌DAA代谢相关的关键酶的多样性，说明海洋细菌拥有不同的DAAs代谢通路。

表 2  海洋细菌DAA代谢相关基因

图4 菌株DAA分解代谢相关基因的相对丰度

4.  菌株SM1926 DAA代谢相关的关键基因鉴定

  图5 菌株SM1926的FQP81_00425基因的相对表达水平

Asp消旋酶编码基因FQP81_00425，是菌株SM1926，D -Asp代谢的关键酶（表5），负责催化Asp由D到L的转变。RT-qPCR进一步验明，FQP81_00425在D-Asp培养基中表达显著上调（图5）。

5. Asp消旋酶编码基因在其他DAA利用菌中的转录分析

图6  菌株SM1923和SM1924的Asp消旋酶编码基因的相对表达水平

除了D -ser 脱氨酶的编码基因FQP87_04910和D -ser 脱氨酶 DSD1的编码基因FQP87_07505外， 菌株SM1924的D -ser代谢可能还与Asp消旋酶的同源编码基因FQP87_05205有关（图6）。

6.  DAA代谢相关的关键酶活性分析

图7  DAAs代谢相关酶活性测量

进一步对DAAs代谢相关酶进行活性分析，发现DAO-11185 和TRA-01185是菌株SM1922的7种DAAs代谢的关键脱氨酶（图7A）, DAO-21520 和DSD1-13285 是菌株 SM1928的D-Ser代谢的关键酶（图7B），DSD-04910是菌株 SM1924的D-Ser代谢的关键酶， DSD-16835是菌株 SM1925的D-Ser代谢的关键酶（图7C），另外AspR-00425是菌株 SM1926的D- Asp代谢的消旋酶（图7D），AspR-05205是菌株 SM1924的 D -Asp的消旋酶，而不是 D -Ser的消旋酶（图7E和F）。因此，这些酶参与了海洋细菌DAAs的代谢过程。