基本信息

文章题目：SMOOTH-seq: single-cell genome sequencing of human cells on a third-generation sequencing platform

期刊：Genome Biology

影响因子：13.583

背景信息

单细胞全基因组测序(scWGS)是一种揭示生物样品中细胞间异质性和识别基因组变化（如拷贝数变异(CNV)和点突变）的强大工具。该技术可用于探索细胞谱系，尤其是肿瘤发生过程中细胞的演变，并能精确挖掘出批量测序中丢失的异质性信息。常见的单细胞基因组扩增方法有：DOP-PCR、多重置换扩增（MDA）技术、多次退火环状循环扩增（MALBAC）技术、和通过转座子插入的线性放大(LIANTI)技术。

目前的scWGS方法都是基于第二代测序平台，生成高度准确但相对较短的读长（数百个碱基对），非常适合于检测拷贝数变异(CNV)、小插入缺失和单核苷酸变异(SNV)，但不是研究结构变异(SV)的最佳选择。SV包括缺失、插入、重复和易位。尽管它是人类体细胞遗传变异的主要来源之一，并且可能是肿瘤发生和转移的驱动力之一，但在单个细胞中很少有研究。另外，最近在人类细胞中发现了染色体外环状DNA(ecDNA)，推测它在癌症发展中起重要作用，单也没有有效的scWGS方法来系统地识别它们。

近年来，单分子实时(SMRT)DNA测序技术已被用于研究人类基因组中的全基因组范围的SV。PacBio平台的HiFi模式生成的CCS读长，实现了高精度(99.8%)的长读长测序。这使得研究SV更容易和可靠。然而，SMRT DNA测序通常需要微克量的DNA来建库，而一个人类细胞只有几皮克的基因组DNA。

研究目的

目前没有有效的方法来检测单细胞全基因组水平上的结构变异(SV)和染色体外环状DNA(ecDNA)。该研究基于SMRT测序技术开发了用于单细胞基因组分析的SMOOTH-seq，利用长且高保真读长的优势实现了准确的SV检测。

研究结果

图1a为SMOOTH-seq的流程示意图。在细胞裂解和蛋白酶消化后，单个细胞的基因组DNA被低浓度的Tn5转座酶随机打断并插入接头。作者对Tn5转座酶的使用进行了优化：替换了商业化试剂中转座反应的缓冲液和PCR扩增的DNA聚合酶。反应只使用了一个Tn5接头序列来避免原始DNA片段丢失。同时，低浓度Tn5转座酶产生的长片段减少了自环化的机会。转座反应后产生的片段使用16bp标签引物进行链置换和扩增。接下来，将带有不同标签的单细胞扩增后gDNA混合在一起并纯化以制备测序文库。使用HiFi模式在Pacbio Sequel II系统上对文库进行测序，并收集CCS读长进行分析。CCS的长度超过1kb，最长可达43693bp，大部分读数约为6kb。

1. 用SMOOTH-seq检测单个K562细胞中的CNV

在分辨率为1Mb的CNV分析中，SMOOTH-seq能检测到两个K562细胞克隆之间的不同拷贝数变异（图1b）。黄色阴影突出了这两个克隆间7号和9号染色体长臂上CNV的差异。

图1

2. 使用SMOOTH-seq检测SV

基因组中的SV通常可以分为缺失、插入、易位、重复和倒位（图2a）。使用K562大量细胞的基因组三代测序结果作为金标准，在两个细胞克隆中，每个单细胞的SV检测精度都很高（76.9%，平均75.2%）（图2b）。对于所有类型的SV，插入是在单个细胞中检测到的最准确的突变（87%，平均84%），缺失位居第二。重复准确率最低（不超过60%）（图2b）。随着两个克隆中支持SV事件的细胞数量增加，SV（主要是缺失和插入）的精度增加（图2c）。在不考虑测序成本的情况下，进一步提高单个细胞的测序深度将有助于提高检测SV的准确性。

图2

3. 通过SMOOTH-seq检测K562中的ecDNA

EcDNA在致癌过程中非常常见，致癌基因可以在ecDNA中扩增。SMOOTH-seq的长读长可以在单次测序读取中捕获小于10kb的全长ecDNA。当只有一个拷贝的Tn5转座酶与ecDNA分子结合时，整个环状DNA分子可以被扩增成一个覆盖其全长的线性片段（图3a）。通过这种方式，可以检测到相同ecDNA的不同拷贝的完全相同长度的不同read，这是串联重复序列中不存在的特征（图3a）。作者从至少两个单独的K562细胞中确定了125个候选ecDNA（图3b）。这些ecDNA主要从5kb到1Mb（图3c），其中29.6%包含基因。90%候选ecDNA可以通过PCR结合Sanger测序进行验证（图3e）。对于8个小于15kb的候选ecDNA，作者使用不同的引物扩增了其全长序列（图3d）。8个候选ecDNA中有6个以成功扩增了预期的全长大小，通过PCR结合Sanger测序进一步验证环化位点（图3d、e）。综合来看，SMOOTH-seq可以准确检测单个细胞中的ecDNA。

图3

4. 检测K562细胞中的SNV

在SNV检测方面，作者首先使用批量NGS测序数据作为对照，评估了在单个细胞中检出SNV的准确性。NGS样本中，总共检测了68,194和87,060个SNV，其中单个细胞平均覆盖率分别为7.5%和6.7%。每个单细胞SNV检测的假阳性率平均为2.0×10-5（图4a）。SMOOTH-seq表现出对CG-to-TA假阳性的偏好（图4b）。这种假阳性已在许多scWGS研究中有广泛报道，并且SMOOTH-seq比以前的scWGS方法有更好的表现。

图4

5. 使用SMOOTH-seq在结肠癌细胞中检测SV

作者对一名结直肠癌患者的96个细胞进行了SMOOTH-seq，在单个细胞中检测到了SV（图5a）。去除与K562细胞中共有的突变，获得结直肠癌细胞特异性SV突变，共3570个SV事件（1376个插入、1661个缺失、230个易位和303个重复）（图5b），并能够识别超过5kb的重复事件（图5c-e）。研究发现在结直肠癌肿瘤样本和K562细胞系中共有的SV，可以在多个人类基因组DNA（肿瘤邻近的正常组织、B细胞系GM12878和来自另一个人的外周血单核细胞）样品中检测到。作者怀疑这是由于目前的人类基因组注释仍然不够完善，第三代测序将有助于组装出更完整的基因组参考序列。

图5

总结

本文提出了一种基于第三代测序技术的单细胞基因组分析新方法SMOOTH-seq。利用读长长和高保真的优势，可以高精度检测基因组结构变异（特别是SV）、ecDNA等事件，该方法在单细胞基因组学领域具有广泛的应用前景。